Ｓｔａｐ事件 ― 小保方氏の研究パートは有益な事実⑥ Irene de Lazaro氏とAustin Smith氏の査読コメントに対する、相澤氏の回答

 

2014年に理研の行ったSTAPの検証実験に関わった、総括責任者相澤真一特任顧問の当該検証論文が2016.6..1付の論文としてオンライン誌「F1000Research」に発表された。

https://f1000research.com/articles/5-1056/v1

その論文中に記載されたIrene de Lazaro氏とAustin Smith氏の査読コメントを、本ブログの“小保方氏の研究パートは有益な事実③http://ryobu.hatenablog.com/entry/2016/09/17/221617)と④http://ryobu.hatenablog.com/entry/2016/09/20/192250)”

に独善的な意訳を紹介した。(これらの記事を参照すると以下が理解しやすくなります)

今回は、2016年9月27日に相澤氏の回答が寄せられていたことを、

中村 公政氏のブログ「白鳥は鳥にあらず」( http://lunedi.sblo.jp/article/177108895.html ) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　及び、tea*r*ak2氏ブログ「理研STAP細胞論文調査委員会報告、改革委提言等への根本的疑問」( http://blogs.yahoo.co.jp/teabreakt2/17560753.html )を見て気づき、またしても独善的な意訳をしてみた。

不適切な個所は多々あるかとは思われるが大筋は理解できるかと思われる。原文も転載したので参照ください。

☆今回の相澤氏の回答には、驚くべき重要な事柄が示されている。

あの理研の検証実験は、一言で言えば、

小保方パートの部分は予備的事項として公開がなされず、キメラ検証を主眼として、その失敗を示す検証になっていた。

その他にも、じっくり味わってみると、大変貴重な内容が暴露されていることに気付くであろうと思われる。

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【Irene de Lazaro氏査読コメントに対する相澤氏の回答】

Irene de Lazaro様                                                                                                        

貴方のコメントに感謝します。貴方の提案を取り入れ、原稿を改訂しました。

私の回答は次の通りです。

1.　ここで報告された監視下での実験を小保方が遂行したその実験室にはフローサイトメーター(FACS)はありませんでした。彼女は以前にはLympholyte-Mを使用して準備した脾臓由来のSTAP細胞を得ていましたので、今回の研究ではこれと同じことが再現できるかを究明しました。もし彼女が成功すれば、我々の計画では次回はFACSでソーティング(分別)したCD45陽性細胞を使ってSTAP細胞を生成しようとしていました。 

2.　取下げたNature論文において使用されたCAG-GFP遺伝子移植マウス系統の由来は明らかではなく、論文中に報告はありませんでした。若山博士はハワイ大学にいる間、彼はCAG-GFPマウス系統を自分自身で生成したと伝えてくれましたが、ここでは正式な調査をしませんでした。そのマウスの系統はもはやCDBの動物施設で維持されておらず、私たちは使用できませんでした。その代わりに、CAG-GFPマウス系統は、実際にはACR / CAG-GFPマウス系統（中西ら、Genomics 80、564-574（2002））であったかもしれません。このことは今野らによる報告(Konno et al., Nature 525,E4-5 (2015))で示唆されています。しかし、我々は小保方の再現実験開始後の報告時にこの可能性を意識するようになっただけでした。いずれの場合においても、元々のSTAP報告書に使用されたとの報告のあるCAG-GFPマウス系統は、現在の検証で用いたCAG-GFPマウス系統（岡部等.1997）とは異なるものです。そうゆうことがあったにせよ、CAG-GFP導入遺伝子の差がSTAP細胞の生成とかキメラ発現の効率に如何なる影響をもたらすかを想到することは困難です。 

3.　取下げたNature論文の図4aには、“STAP”細胞を注入した胚ははっきりとした透明体を持っています。

しかしながら、E4.5胚は、典型的には、もはやこのような構造を持っていません。透明帯が存在しない場合には注入は事実上不可能です。E0は一般的にプラグが識別された時、一日の午前0時のように定義されていることを記し、そしてE4.5はE3.5の誤植であるかもしれないと提示しています。あるいはまた、若山博士は人為的に胚の発育を遅らせた可能性もあります。しかしながら、このことは取下げたNature論文では報告されていませんでした。

4.　C57BL / 6バックグラウンドで、細胞塊の形成効率がATP処理とHCl処理間で有意差があることを示す統計分析（t検定）を此処に盛り込みました。しかし、その差はわずかです。それに応じて原稿中の(Table 1 and page 5 in the text)を修正しました。 

5.　小保方によって生成された細胞塊の多能性はキメラ試験法を用いて示されており、このことが報告されたSTAP現象の中心的特徴であるので、ここに焦点を絞って検証しました。考察の中に記したように、本研究の時間の制約を考えると、他のデータは必要上で限られることになりました。本検証の焦点ではなかったので、可能性は高いとは思うが、観測された赤色蛍光が自家蛍光であったと私は断言できないのです。緑色蛍光を発する他の細胞塊には発現はなかったが、GFP発現に対するRT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）分析では、いくつかの凝集塊に有意な発現を検出しました。しかし、これらのデータは最高の状態で予備的なものとされ発表されることはありませんでした。 

6.　 脾臓の遺伝的背景における、細胞塊形成とキメラ形成能の両方の効果をC57BL / 6とF1（C57BL6　x 129）バックグラウンドで検査しました。ES細胞培養は遺伝的背景が強く影響することが知られています。このような両方の背景が取下げた論文で使用されました。今回この点を明確にするために、原稿の(page 4 and page 6)を修正しました。

7.　丹羽レポートでの細胞凝集体は丹羽によって準備されたのであり、小保方によるものではありません。

8.　その2つのレポートは、今回引用し、簡単にざっと考察(page 8–9)しています。これらの仕事は、キメラ試験法により多能性を調べていなかったが、本報告書の最も重要な問題は、小保方自身で調製した細胞塊がキメラ試験法で多能性を示さなかったということです。

Best regards,

 Shin Aizawa

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（原文） 

Author Response 27 9 2016

 Shinichi Aizawa, RIKEN Center for Developmental Biology, Japan

Dear Dr. Irene de Lazaro,

 I thank you for your comments. The manuscript was revised incorporating your suggestions. My responses are as follows:

   1.There was no FACS cell sorter in the laboratory in which Obokata performed the set of supervised experiments reported here. She had previously obtained “STAP” cells using splenocytes prepared using Lympholyte-M, so we sought to determine whether she was able to repeat this in the present study. If she had succeeded, our plan was next to generate STAP cells using CD45+ cells sorted by FACS.

2.The origin of the cag-gfp transgenic mouse line used in the retracted Nature papers is unclear, and was not reported in the papers. Dr. Wakayama informed us that he generated the cag-gfp mouse line himself while at the University of Hawaii, but we did not make a formal investigation into this. The mouse line was no longer maintained in the animal facility of CDB and was not available to us. Alternatively, the cag-gfp mouse line may have been actually an Acr/cag-gfp mouse line (Nakanishi et al., Genomics 80, 564-574 (2002)) as suggested in the report by Konno et al (Konno et al., Nature 525,E4-5 (2015). However, we only became aware of this possibility at the time of that report, which was after the start of Obokata’s replication attempt. In any case, the cag-gfp mouse line reportedly used in the original STAP reports is different from the cag-gfp mouse line (Okabe et al., 1997) we used in the present study. It is nonetheless difficult to conceive how the difference in cag-gfp transgene might affect the efficiency of “STAP cell” production and chimera generation.

3.In Fig. 4a of the retracted Nature article, the embryo being injected with “STAP” cells clearly has a zona pellucida. However, E4.5 embryos typically no longer have this structure. In the absence of zona pellucida, injection is practically impossible. We note that E0 is generally defined as 0:00 am of the day when the plug is identified, and suggest that E4.5 may be a typographic error for E3.5. Alternatively, Dr. Wakayama may have artificially delayed the development of the embryo; however, this was not reported in the retracted Nature paper.

4.We have now included a statistical analysis (t-test), which indicates that the efficiency of cell aggregate formation is significantly different between ATP treatment and HCl treatment in the C57BL/6 background. However, the difference is slight. We have revised the manuscript accordingly (Table 1 and page 5 in the text).

5.This study focused on the multipotency of cell aggregates generated by Obokata using a chimeric assay as this was the central feature of the reported “STAP” phenomena. Given the time constraints of this study, other data were necessarily limited, as noted in the Discussion. As it was not the focus of the present study, I cannot state definitively that the red fluorescence observed was autofluorescence, although I feel that this is highly likely. RT-PCR analysis for GFP expression showed significant expression in several aggregates, but not in others that showed green fluorescence; however, these data were preliminary at best and are not presented.

6.The effects on both cell aggregate formation and chimeric potency of the spleens’ genetic background were examined in the C57BL/6 and F1(C57BL6 x 129) background. It is well known that ES culture is strongly influenced by genetic background. Both of these backgrounds were used in the retracted Nature papers. I have now revised the manuscript (page 4 and page 6) to clarify this point.

7.The cell aggregates in Niwa’s report were prepared by Niwa, not by Obokata.

8.The two reports are now cited and briefly discussed (page 8–9). These works did not examine multipotency by chimeric assay, and the most important issue of the present report is that cell aggregates prepared by Obokata herself did not exhibit multipotency in chimeric assays.

 Best regards,

 Shin Aizawa

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【Austin Smith氏査読コメントに対する相澤氏の回答】

 Austin Smith　様                                                                                

貴方のコメントに感謝いたします。貴方の提案を取り入れ、原稿を改訂しました。

私の回答は次のとおりです。

１.　表1の見出しを変更しました。

２.　全てのOCT-GFP細胞凝集体は、ある程度の蛍光を示しました。

３.　細胞塊は野生型脾細胞から生成されませんでした。細胞塊の緑色蛍光強度とOCT-GFP胚あるいはES細胞の中でのそれらの強度の直接的な比較は行いませんでした。私は緑と赤の蛍光が自家蛍光であったかどうかを確実に述べることはできません。GFP発現に対するRT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）分析は、いくつかの凝集塊において有意な発現を検出したが、緑色蛍光を示した他の物には無く、これらのデータは非常に予備的なことだったとして表示されていません。キメラ試験法を用いて、小保方により生成された細胞塊の多能性が示されており、このことがSTAP現象の中心的特徴であるので、ここに焦点を絞って検証しました。考察の中で述べたように、他のデータはただ単に、検証の時間制約の下での予備的なものでした。

4.　キメラを作製するために、細胞塊はCAG-GFP脾細胞を用いて準備しました。このようにGFP発現または緑色蛍光を細胞塊を選択するための尺度として使用できていません。この理由のために、細胞クラスタの形態によって細胞塊を選定することができただけでした。本研究では小保方の判断に完全に依存して選定されたものでした。彼女が成功した場合は、次の我々の計画では、「細胞クラスタの形態」を正確に記述するように彼女に要求するつもりでした。

5　8細胞期でCAG-GFP細胞凝集体を注入し、一日間培養して胚盤胞期に達するところの多くの胚は、緑色蛍光細胞の存在について試験され、そしてそのような細胞が存在することが見出されていました。

6.　 キメラ程度は全マウント中のE9.5またはE8.5で調べました。取下げたNature論文は細胞の大規模なコロニー形成を示しています(Fig. 4 in the Article and Fig. 1 and Extended Data Fig. 1 in the Letter)　。　

アーティクル論文(The article)では、得られた48キメラの内で8つのキメラ胚が50％以上の毛色の寄与を示したことを報告しました。これらの動物から「STAP」由来の子孫が得られました。これは、今では取下げられたSTAPレポートの中心的所見でした。しかしながら、今回の本検証では、レター論文の図など(Fig. 4 in the article and Fig. 1 and Extended Data Fig. 1 in the Letter)に示されたようなキメラは得られませんでした。そればかりでなく、コート色素沈着に50％以上の貢献度を示すようなキメラは全く得られませんでした。勿論1％たりともキメラになることはありませんでした。私は今、それに応じてテキストを改訂しています。これは本研究のポイントではなかったので、我々は、使用したCAG-GFPマウス系統で検出限界（セルの最小数）を検討していません。しかし、私は沢山の数の細胞がいずれの組織にも共存するなら、E9.5またはE8.5の全マウント中に検出可能であっただろうと信じています。

Best regards,

 Shin Aizawa

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（原文）

Author Response 27 9 2016

 Shinichi Aizawa, RIKEN Center for Developmental Biology, Japan

Dear Dr. Austin Smith,

 I thank you for your comments. The manuscript was revised incorporating your suggestions. My responses are as follows:  1.The headings in Table 1 have been changed as suggested.

2.All oct-gfp cell aggregates exhibited fluorescence to some degrees.

3.No cell aggregates were generated from wild-type splenocytes. No direct comparison was made of the intensities of green fluorescence of cell aggregates with those in oct-gfp embryos or ES cells. I cannot state with certainty whether the green and red fluorescence was autofluorescence. RT-PCR analysis for GFP expression showed significant expression in several aggregates, but not in others that had green fluorescence; these data were very preliminary and thus are not shown. This examination focused on the multipotency of cell aggregates generated by Obokata using a chimeric assay, since this was the central feature of the STAP phenomena. Other data were only preliminary given the time constraints under which these experiments were performed, as described in Discussion.

4.To make chimeras, cell aggregates were prepared with cag-gfp splenocytes, thus GFP expression or green fluorescence cannot be used as a measure for the selection of cell aggregates. For this reason, they could only be selected by cell cluster morphology. In the present study, the selection was dependent entirely on Obokata’s judgment. If she had succeeded, our plan was next to ask her to describe “cell cluster morphology” precisely.

5.Many embryos injected with cag-gfp cell aggregates at 8-cell stage and cultured for one day to the blastocyst stage were examined for the presence of green-fluorescent cells, and such cells were found to be present.

6.Chimeric extent was examined at E9.5 or E8.5 in whole mount. The retracted Nature papers show extensive colonization of the cells (Fig. 4 in the Article and Fig. 1 and Extended Data Fig. 1 in the Letter). The article reported eight chimeric embryos, showing more then 50% coat color contribution, of 48 chimeras obtained; these animals yielded “STAP”-derived offspring. This was the central finding in the now-retracted STAP reports. However, in the present study, no chimera equivalent to those in Fig. 4 in the article and Fig. 1 and Extended Data Fig. 1 in the Letter was obtained, nor were any chimeras obtained showing more than 50% contribution to coat pigmentation. Indeed, no chimera showing more than 1% contribution was obtained. I have now revised the text accordingly. We have not examined the limit of detection (minimum number of cells) with the cag-gfp mouse line used, since this was not the point of the present study. However, I believe it to be the case that if dozens of cells had been present together in any tissue, they would have been detectable in whole mount at E9.5 or E8.5.

 Best regards,

 Shin Aizawa

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